斑马鱼模型中的线粒体功能障碍改善非酒精性脂肪性肝病

 

本研究旨在探究CCT对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的治疗效果，并阐明线粒体功能与CCT疗效之间的关系。通过体外（L02细胞）和体内（斑马鱼）实验探究CCT对NAFLD模型的影响，结果表明CCT是一种潜在有效的NAFLD治疗药物。此外，CCT通过减轻线粒体功能障碍对NAFLD发挥治疗作用。 标题：Crocetin ameliorates non-alcoholic fatty liver disease by modulating mitochondrial dysfunction in L02 cells and zebrafish model 期刊：Journal of Ethnopharmacology 285 (2022) 114873 原文链接：

www.elsevier.com/locate/jethpharm 摘要 民族药理学相关性：中医认为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的病因病机与肝郁气滞有关。藏红花及其活性成分西红花酸（CCT）因其 “疏肝” 和 “补肝” 作用而用于治疗代谢性疾病。然而，CCT对NAFLD的作用尚未完全阐明。在本研究中，通过NAFLD体内和体外模型探讨了CCT的作用及潜在分子机制。 材料与方法：从藏红花中分离出CCT，并使用高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）、\(^{1} H\) -核磁共振（NMR）和\(^{13} C\) -核磁共振（NMR）对其纯度和结构进行表征。研究了CCT对L02细胞活力的影响及其在斑马鱼中的最大耐受浓度（MTC）。分别使用游离脂肪酸（FFA）和硫代乙酰胺（TAA）诱导L02细胞中的脂质积累和斑马鱼的脂肪变性。使用生化检测试剂盒、蛋白质免疫印迹分析（Western blot analysis）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、组织病理学分析以及线粒体膜电位（ΔΨm）测定，探究CCT对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型中与脂质代谢、氧化应激和线粒体功能相关指标的影响。使用透射电子显微镜（TEM）对线粒体进行形态学分析。 结果：在游离脂肪酸（FFA）处理的L02细胞中，CCT处理后，甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、丙二醛（MDA）水平以及丙氨酸/天冬氨酸转氨酶（ALT/AST）活性显著降低。CCT处理显著提高了FFA处理的L02细胞中的ATP浓度、线粒体膜电位（ΔΨm）以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和细胞色素c氧化酶（COX IV）的活性。透射电子显微镜（TEM）图像显示线粒体形态得到恢复。在硫代乙酰胺（TAA）处理的斑马鱼中，CCT降低了ATP浓度，上调了B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和COX IV的表达，而下调了BCL2相关X蛋白（Bax）和裂解的半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）的表达。这些结果表明，CCT处理后线粒体功能障碍得到缓解。L02细胞和斑马鱼的油红O染色显示，CCT处理逆转了脂滴的积累。 结论：综上所述，CCT治疗有效地缓解了非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的症状，并恢复了L02细胞和斑马鱼非酒精性脂肪性肝病模型中的线粒体功能。 引言 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种慢性肝病，在全球范围内具有较高的患病率。大多数非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者无明显症状，20% 的 NAFLD 病例会进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）（Ferramosca 等人，2017年）。因此，迫切需要需要确定新的治疗靶点并开发针对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的有效药物。涉及线粒体功能障碍、氧化应激、内质网应激和炎症反应的 “两次打击” 和 “多次打击” 假说已被广泛用于探索NAFLD的分子发病机制（恩金，2017年；杨等人，2019年）。线粒体在能量产生、细胞凋亡、氧化应激和脂质代谢中发挥关键作用，因此，这两个假说表明线粒体功能在NAFLD的起始和进展中具有重要作用（贝克和弗里德曼，2018年）。线粒体是包括肝细胞在内的所有细胞的能量来源，因此，线粒体功能下降，伴随着结构和分子改变，可能导致代谢紊乱，最终促进NAFLD的进展（沙米等人，2021年）。此外，线粒体功能障碍会刺激活性氧（ROS）的产生、氧化应激、去极化、破坏合成三磷酸腺苷（ATP）的能力，并导致脂肪酸氧化受损（格拉塔利亚诺等人，2019年）。因此，线粒体形态和功能的变化是NAFLD进展的一个标志（法鲁乔等人，2020年）。 藏红花来源于番红花（Crocus sativus L.）植物的干燥柱头，属于鸢尾科多年生无茎草本植物（博斯坦等人，2017年）。先前的几项研究报告称，藏红花及其成分具有多种生物活性，包括抗炎、抗肿瘤、抗阿尔茨海默病和抗抑郁活性（巴塔伊等人，2013年；查拉察等人，2019年；林等人，2020年）。在一些传统的伊斯兰医学专著中，如《医学智慧乐园》（Ferdows al-Hekmah fi’l-Tibb ）和《医学综合书籍》（Al-Hawi fi’l-Tibb ），记载了藏红花在肝脏疾病方面的传统用途，包括用作 “肝脏疏通剂” 和 “肝脏补剂”（贾瓦迪等人，2013年）。先前一项临床试验的结果表明，藏红花能显著提高非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者的总抗氧化能力，并降低高敏C反应蛋白（hs-CRP）、瘦素和丙二醛（MDA）水平（普尔等人，2020年）。然而，藏红花治疗非酒精性脂肪性肝病的确切机制和活性成分尚未阐明。先前的研究表明，藏红花中的主要类胡萝卜素藏红花苷，在口服后会在肠道中水解为西红花酸（CCT），然后以西红花酸的形式被吸收进入血液循环（浅井等人，2005年；马什穆尔等人，2014年）。此外，研究报告称，西红花酸在体内和体外对线粒体均起到保护作用（迪·埃米迪奥等人，2017年；董等人，2020年）。因此，我们假设藏红花通过西红花酸的作用调节线粒体功能障碍，从而在缓解非酒精性脂肪性肝病方面发挥治疗作用。 材料与方法 植物材料 藏红花样品采自中国浙江省建德市三都镇生活农业发展有限公司，作者依据《中国药典》对其进行了植物学鉴定。一份凭证标本（编号CCT20181012）保存在浙江工业大学植物标本馆。

西红花酸（CCT）的制备与分析 按照先前描述的方法（Lin等人，2020年）从藏红花中分离藏红花酸三甲酯（CCT）。将100克藏红花与1.4升70%乙醇溶液混合，然后在50℃下用超声（功率100瓦）萃取3次，每次1小时。合并提取物，在减压下浓缩。提取物经大孔树脂D101萃取。依次用8倍床体积的水、25%乙醇和60%乙醇洗脱提取物。浓缩60%乙醇洗脱液得到100mL溶液。然后加入氢氧化钠（2mol/L）将溶液pH调至约12，混合物在室温下孵育12h。再加入\(H_{2} SO_{4}\)（1mol/L）将pH调至约2，混合物在4℃下沉淀过夜。然后将混合物离心得到沉淀，即为CCT粗提物。粗提物用含0.5% \(H_{2} SO_{4}\)的1L甲醇洗涤两次，再用双蒸水洗涤进行纯化。通过离心获得纯化的CCT，并在60℃真空烘箱中干燥过夜。

采用先前描述并略作修改的方法进行CCT分析（Tong等人，2015a）。使用配备二极管阵列检测器（DAD）的安捷伦1260高效液相色谱系统评估CCT的纯度。使用Eclipse XDB - C18分析柱（150 mm×4.6 mm，5μm，美国安捷伦公司）进行色谱分离。流动相由甲醇（A）和0.2% 乙酸 - 水（B）组成，梯度洗脱程序设置如下：0 - 10分钟，A相由80% 升至87%；10 - 15分钟，A相由87% 升至100%。其他参数设置如下：检测波长440 nm；流速1 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL。使用（-）电喷雾电离串联质谱（扫描范围50至1500 m/z，毛细管电压3000 V，锥孔电压60 V，离子源温度150℃，溶剂气体流速600 L/h，脱溶剂温度450℃）确定CCT的结构，使用\(^{1} H\)核磁共振（600 MHz，DMSO - \(d_{6}\)）以及\(^{13} C\) - 核磁共振（151 MHz，DMSO - \(d_{6}\)）对CCT进行结构分析。 试剂与化学品 正常人类肝细胞系L02购自北纳创联生物技术研究院（中国北京）。胎牛血清（FBS，批号：20050504）购自天杭生物科技公司（中国杭州）。RPMI - 1640培养基（批号：2012070203）和含0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶（批号：20201031 - 0907）购自森瑞生物技术公司（中国湖州）。油酸（OA，批号：Z07M10Y87671）购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。油红O染料（批号：SLBP5248V）购自Sigma - Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。苏木精（批号：YH0170326）和伊红染料（批号：YH180124）购自屹禾生物技术公司（中国上海）。硫代乙酰胺（TAA，批号：BCBV3031）、S - 腺苷甲硫氨酸（SAM，批号：A1810036）和棕榈酸（PA，批号：E1921195）购自阿拉丁公司（中国上海）。iTaq Universal SYBR Green Supermix（批号：1725124）购自伯乐诊断公司（美国加利福尼亚州）。总胆固醇（TC）检测试剂盒（批号：20200804）、甘油三酯（TG）检测试剂盒（批号：20200804）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒（批号：20200805）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（批号：20200803）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（批号：20200805）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（批号：20200810）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（批号：20200713）、ATP检测试剂盒（用于L02细胞，批号：20201207）、线粒体蛋白提取试剂盒（批号：20201103）和电子传递链COX IV检测试剂盒（批号：20201206）购自建成公司（中国南京）。线粒体膜电位与凋亡检测试剂盒（批号：092120201110）、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（批号：88417）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（批号：09041919224）和ATP检测试剂盒（用于斑马鱼，批号：04021919022）购自碧云天公司（中国上海）。Fast Quant RT Kit（货号：KR106）购自天根生化科技（北京）有限公司。

试剂盒（目录号RN001）购自中国上海亿山生物技术有限公司。增强化学发光（ECL）试剂盒（目录号AS1059）购自中国武汉阿斯彭生物有限公司。β-肌动蛋白抗体（目录号200068 - 8f10）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体（目录号511103）购自中国成都正能生物技术有限公司。抗细胞色素C氧化酶亚基IV（COX IV）抗体（目录号ab14744）、抗B细胞淋巴瘤-2（Bcl - 2）蛋白抗体（目录号ab182858）、抗Bcl - 2相关X蛋白（Bax）抗体（目录号ab32508）和抗剪切型半胱天冬酶3（cleaved caspase 3）抗体（目录号ab214430）均购自英国剑桥Abcam公司。所有化学试剂均为分析纯。 细胞培养与处理 正常人类肝细胞系（L02细胞）在添加有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI - 1640培养基中，于37℃、含5% \(CO_{2}\)的湿润培养箱中培养。将L02细胞暴露于终浓度为500 μM的游离脂肪酸混合物（油酸和棕榈酸，最终摩尔比为2:1）中48小时，以诱导脂质积累。然后，用浓度为2.5、5和10 μM的CCT共同处理细胞。单独用500 μM游离脂肪酸处理的L02细胞作为模型组，而在正常培养基中培养的细胞作为对照组。 细胞活力检测 采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细胞活力（Gao等人，2018年）。将L02细胞接种到96孔板中（每孔\(1 ×10^{4}\)个细胞，100微升），培养基为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI - 1640培养基，培养12小时。弃去培养基，加入不同剂量的游离脂肪酸（FFA，100、300、500、700和900 μM）、CCT（1.25、2.5、5、10、20和40 μM），或FFA与CCT的混合物（500 μM FFA + 2.5 μM CCT、500 μM FFA + 5 μM CCT、500 μM FFA + 10 μM CCT）。以二甲基亚砜（DMSO）作为处理对照。然后将细胞孵育48小时，加入20 μL 5 mg/mL的MTT，继续孵育4小时。随后，加入100 μL DMSO溶解生成的甲臜。使用酶标仪（Epoch，美国BioTeK公司）在570 nm处测定吸光度。细胞活力以处理后细胞活力相对于未处理细胞活力的百分比表示。 油红O染色

采用油红O染色对积累的中性脂肪进行组织学观察（Correnti等人，2018年）。将细胞与500μM游离脂肪酸（FFA）在有或无不同浓度CCT的条件下孵育48小时。孵育后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次。然后，用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，用60%异丙醇冲洗5分钟，之后在室温下用油红O工作液染色20分钟。使用倒置光学显微镜（奥林巴斯IX81，日本，放大倍数400×）获取脂质积累的图像。在异丙醇中孵育10分钟后，采用490纳米处的光密度进行最终分析。 生化参数分析 通过测定细胞内天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和过氧化氢酶（CAT）水平，探究细胞损伤和氧化应激情况。根据制造商说明，使用相应检测试剂盒进行检测。将细胞用500μM游离脂肪酸（FFA）处理，同时添加或不添加不同浓度的CCT，处理48小时，然后检测细胞内AST、ALT、TG和TC水平。将细胞培养基在4℃下以1000转/分钟的速度离心（TC - M600D；Topscien）5分钟，以去除死细胞和碎片。使用自动生化分析仪（型号7600；日本日立公司）测定上清液中的AST、ALT、TG和TC水平。细胞内SOD水平，丙二醛（MDA）和过氧化氢酶（CAT）也使用相应试剂盒进行了分析。 ATP水平分析 使用ATP检测试剂盒，按照制造商说明（N. Li等人，2020年）测定对细胞死亡敏感的细胞内ATP浓度。将细胞分离，以1000转/分钟的速度离心5分钟收集，然后在热双蒸水（90 - 100℃）中匀浆。接着将细胞悬浮液在沸水浴中加热10分钟，使细胞内ATP水解酶失活。之后，将细胞悬浮液涡旋混合1分钟，随后依次加入不同试剂。使用紫外 - 可见分光光度计（UV - 1800；日本岛津公司）在635纳米波长处测定样品的吸光度。 线粒体膜电位（\((\Delta \Psi_{m})\)检测法 使用线粒体膜电位与细胞凋亡检测试剂盒，通过Mito-Tracker Red CMXRos和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）染色，测定线粒体膜电位（\((\Delta \Psi_{m})\)）（Yu等人，2021年）。吸出培养基并置于一旁，通过胰蛋白酶消化使细胞脱离。使用吸出的培养基终止胰蛋白酶反应。然后将脱离的细胞以1000转/分钟的转速离心5分钟。小心弃去上清液，将细胞重悬于188微升的Annexin V-FITC结合溶液中。随后加入2微升的Mito-Tracker Red CMXRos和5微升的Annexin V-FITC染色剂，混合物在20 - 25℃的黑暗条件下孵育25分钟。将细胞样本置于冰上，并在1小时内使用倒置荧光显微镜（IX81，日本奥林巴斯，放大倍数400×）进行分析。红绿荧光强度之比表明了\(\Delta \Psi_{m}\)的变化情况。 细胞色素C氧化酶IV活性分析 使用线粒体蛋白提取试剂盒和电子传递链复合物IV检测试剂盒，按照制造商的说明测定COX IV的活性。该检测基于细胞色素C的氧化与COX IV相关这一事实，550纳米处的吸光度反映了COX IV的活性（Bindra等人，2021年）。收集细胞并裂解，在4℃下以1000转/分钟的低速离心5分钟，弃去细胞碎片。通过在12000转/分钟下高速离心10分钟获得线粒体。然后使用补充有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液裂解线粒体。以12000转/分钟的速度离心15分钟去除碎片。使用上清液测定蛋白质浓度和COX IV活性。 线粒体的透射电子显微镜（TEM）分析

处理后，细胞在1000转/分钟的条件下离心，然后在含有2.5%戊二醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲液中于4℃固定12小时。随后，细胞用0.1M二甲胂酸盐缓冲液洗涤三次，接着用1%锇酸后固定2小时。进一步地，吸出并弃去锇酸，细胞用0.1M二甲胂酸盐缓冲液洗涤三次（每次15分钟）。然后，通过在浓度递增的乙醇中孵育使细胞脱水。细胞通过在包埋剂和丙酮的混合物（体积比：\(V=1: 1\)）中孵育1小时进行包埋，随后在相同混合物的不同浓度（体积比：\(V=3: 1\)）中孵育3小时。然后，细胞在包埋剂中孵育过夜，并在60℃加热过夜。使用切片机（EM UC7；德国徕卡）将样品切成70 - 90纳米的超薄切片，先用柠檬酸铅溶液染色，接着用50%乙醇饱和的醋酸铀溶液染色10分钟。样品干燥后，在透射电子显微镜（H - 7650； ）下观察线粒体的形态。 斑马鱼胚胎采集的标准程序 成年斑马鱼饲养在光照和温度可控的水产养殖设施中，光照/黑暗周期为标准的14:10小时。每天投喂两次活卤虫和一次干鱼粮。每次让四到五对斑马鱼进行自然交配。平均每次可产生200 - 300个胚胎。胚胎在28℃的鱼水中培养（去离子水中添加0.2%的速溶海盐，pH值6.5 - 8.5，电导率450 - 550 μS/cm，硬度50 - 100 mg/L \(CaCO_{3}\) ）。然后将胚胎清洗并在受精后72小时（hpf）进行分期，以用于后续实验。该斑马鱼养殖设施获得了国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）的认证（Liu等人，2017年）。 斑马鱼中CCT最大耐受浓度（MTC）分析 为探索治疗剂量，首次对斑马鱼中CCT的最大耐受浓度（MTC）进行了研究（Zhu等人，2019年）。将白化斑马鱼转移至6孔微孔板中，并给予1000 μM硫代乙酰胺（TAA）和不同浓度（0.62、1.25、2.5、5、10、20和40 μM）的CCT。仅用1000 μM TAA处理的斑马鱼作为模型组，而用养鱼水饲养的斑马鱼作为对照组。暴露72小时后，在配备数码相机的体视显微镜（SZX7，日本奥林巴斯公司）下观察斑马鱼并采集图像。肉眼评估斑马鱼的主要器官和组织，并根据死亡率和形态异常估计MTC。 斑马鱼肝脏油红O染色分析 给白化斑马鱼投喂1000 μM的硫代乙酰胺（TAA），并联合不同浓度（1.1、3.3和10 μM）的CCT。单独用1000 μM TAA处理的斑马鱼作为模型组，而用1000 μM TAA和50 μM S-腺苷甲硫氨酸（SAM）处理的斑马鱼作为阳性对照组。用养鱼水饲养的斑马鱼作为正常对照组。处理72小时后，将斑马鱼在4℃下用4%多聚甲醛固定过夜。然后用养鱼水冲洗鱼体两次，接着用油红O染色，之后在体视显微镜（SZX7，奥林巴斯，日本，112×）下拍照。使用尼康NIS-Elements D 3.10软件对肝脏脂肪染色强度（N）进行量化。使用以下公式计算肝脏脂肪变性百分比的降低值： 组织病理学分析 斑马鱼的处理方法如2.14节所述。然后，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切成10微米厚的切片。之后，切片常规进行苏木精-伊红（H&E）染色，用于组织病理学分析（Zhou等人，2020年）。 ATP浓度分析 斑马鱼的处理方法如2.14节所述。随后使用ATP检测试剂盒测定ATP浓度。使用多功能酶标仪（SPARK，TECAN，瑞士曼嫩多夫）测定相对发光单位（RLU，A）。ATP提升百分比使用以下公式计算： 表1 用于mRNA表达分析的引物 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析细胞色素C氧化酶亚基IV（COX IV）信使核糖核酸（mRNA）表达水平 斑马鱼的处理方法如2.14节所述。从斑马鱼中提取mRNA，并用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）探究COX IV的基因表达水平。在受精后第5天从胚胎中分离RNA，并用于RT-PCR分析。使用RNA快速纯化试剂盒提取总RNA。然后从2微克总RNA合成cDNA，并用于RT-PCR。RT-PCR程序设置如下：步骤1：95℃持续2分钟，步骤2：95℃持续0.05秒，步骤3：60℃持续30秒，步骤4：步骤2 - 步骤3循环39次，步骤5：95℃持续0.05秒，步骤6：65℃持续0.05秒，95℃持续0.5秒。RT-PCR所用引物见表1。β - 肌动蛋白（β -actin）在RT-PCR中用作参考mRNA。使用\(2^{-\Delta \Delta c q}\)方法计算CCT对相对mRNA基因表达的影响。 蛋白质免疫印迹分析 斑马鱼的处理方法如2.14节所述。从斑马鱼中提取总蛋白，并通过蛋白质免疫印迹分析，测定COX IV、裂解的半胱天冬酶3、Bax和Bcl-2蛋白的表达水平。使用BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。将蛋白质与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）样品缓冲液在100℃下孵育5分钟，然后使用含三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸SDS的缓冲液作为电泳缓冲液，通过SDS - PAGE进行分离。电泳后，使用含20%甲醇的三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸SDS转膜缓冲液，以80毫安的电流在1小时内将蛋白质转移到Immobilon - P聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。然后用WesternBright染料对膜进行染色，以便快速可逆地检测蛋白条带。使用Image J软件对蛋白条带进行定量分析。 统计分析 所有统计分析均使用SPSS 26.0软件包（美国伊利诺伊州芝加哥市IBM SPSS公司）进行。数据以平均值±标准差表示。实验组之间的比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行事后LSD检验。使用Image J 1.4软件（美国国立卫生研究院）分析和比较条带强度。当\(p<0.05\)时，组间差异被认为具有统计学意义。

结果

黄连总碱的表征 高效液相色谱分析结果表明，从藏红花中提取的CCT由两种异构体组成（图1A）。采用面积归一化法分析表明，反式CCT异构体占CCT总浓度的95%以上，这与我们之前的研究结果一致（Tong等人，2015b）。使用（-）电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）确定了CCT的结构，质荷比m/z为327[M-H]-（图1B），其对应的分子式为\(C_{20} H_{24} O_{4}\)，与之前报道的研究结果一致（Y. Li等人，2020年；Moras等人，2018年）。

图1. 可可碱（CCT）的表征。(A) 440纳米波长下可可碱（CCT）的高效液相色谱图。(B) 可可碱（CCT）的（-）电喷雾串联质谱图。(C) 可可碱（CCT）的\(The\) 氢核磁共振谱图。(D) 可可碱（CCT）的碳-13核磁共振谱图。 图2. CCT和游离脂肪酸（FFA）对L02细胞活力的影响。(A) 用不同剂量的游离脂肪酸（100、300、500、700和900 μM）和二甲基亚砜（DMSO）处理细胞48小时。(B) 用不同剂量的CCT（1.25、2.5、5、10、20和40 μM）和二甲基亚砜处理细胞48小时。(C) 用不同剂量的游离脂肪酸和CCT（500 μM游离脂肪酸 + 2.5 μM CCT、500 μM游离脂肪酸 + 5 μM CCT、500 μM游离脂肪酸 + 10 μM CCT）和二甲基亚砜处理细胞48小时。通过MTT法检测细胞活力。* \(* * P<0.01 vs\)。对照组。\(^{*} P<0.05\)和\(\# \# P<0.01\)与游离脂肪酸组相比。数值以平均值± \((n=4)\)表示 双键区域（图1C），而通过\(^{13} C\)核磁共振分析观察到七种共轭13烯烃碳（图1D），代表两个季碳（C6，C11）。此外，\(^{13} C\)核磁共振显示在δ13.26和δ13.01处存在两个碳甲基信号，对应于\(^{1} H\)核磁共振中61.98（s，6H）和61.92（s，6H）处的键区域，表明该化合物有四个甲基（C16，C17，C18，C20）。此外，在\(^{1} H\)核磁共振中观察到δ12.18处的信号，代表羧基氢，而在\(^{13} C\)核磁共振中观察到δ169.58处的信号代表羧基碳（C1，C19）。 \(^{1} H\)的核磁共振信号（600兆赫兹，DMSO- \(d_{6})\)）如下：δ 12.18（单峰，2H），7.21（双峰，\(J=11.4\) ，2H），6.88 - 6.79（多重峰，2H），6.73（双峰，\(J=\) 15.0赫兹，2H），6.67 - 6.57（多重峰，2H），6.50（双二重峰，\(J=7.8\) ，3.0赫兹，2H），1.98（单峰，6H），1.92（单峰，6H）。通过\(^{13} C\)的核磁共振（151兆赫兹，氘代二甲亚砜）获得的信号包括：δ 169.58、143.78、138.49、137.12、135.76、132.09、127.41、124.56、13.26和13.01。 细胞活力测定 细胞活力测定结果显示，高剂量的游离脂肪酸（FFA）和CCT显著降低了细胞的生长速率（图2A和B）。更具体地说，500 μM及以上剂量的FFA和20 μM及以上剂量的CCT显著降低了细胞活力。值得注意的是，用500 pM FFA与2.5、5或10 pM的CCT联合处理细胞后，细胞活力显著增加（图2C）。因此，在后续实验中选择500 μM FFA诱导脂质积累，而使用2.5、5和10 μM剂量的CCT来探究CCT对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型的治疗效果。 黄连碱对L02细胞内脂质积累的影响 图3. CCT对细胞内脂质积累的影响。(A) L02细胞油红O染色图像（放大倍数400×）。蓝色虚线表示下排大于上排。对照组用RPMI-1640处理48小时；游离脂肪酸（FFA）组用500μM FFA处理48小时；CCT组分别用500μM FFA和不同剂量的CCT（2.5、5和10μM）处理48小时。(B) 在490nm处油红O的脂质积累定量分析（结果采用倍数变化进行分析）。数值以平均值±标准差表示。\((n=6)\) \(* * P<0.01\)与对照组相比。\(\# * P<0.01\)与FFA组相比。（关于本图中颜色引用的解释，读者可参考本文的网络版本。）

图4. 黄连碱对游离脂肪酸（FFA）处理的L02细胞损伤及氧化应激的影响。对照组用RPMI-1640处理48小时；FFA组用500μM FFA处理48小时；黄连碱（CCT）组分别用500μM FFA和不同剂量的CCT（2.5、5和10μM）处理48小时。（A）细胞内天冬氨酸转氨酶（AST）。（B）细胞内丙氨酸转氨酶（ALT）。（C）细胞内甘油三酯（TG）。（D）细胞内总胆固醇（TC）。（E）细胞培养上清液中的AST、ALT、TG和TC。（F）细胞内丙二醛（MDA）。（G）细胞内超氧化物歧化酶（SOD）。（H）细胞内过氧化氢酶（CAT）。数据以平均值±标准差表示。\((n=6)\) \(\because P<0.01\)与对照组相比。\(^{*} P<0.05\)和\(\# \# P<0.01\)与FFA组相比。

通过测量490纳米处的吸光度来测定CCT对细胞内脂质积累及相对脂质含量的影响。分析结果显示，游离脂肪酸（FFA）组的相对脂质含量是对照组脂质含量的4.36倍。 值得注意的是，三种剂量的CCT给药显著降低了细胞内脂质积累\((P<0.01)\)。这一发现表明成功诱导了细胞内脂质积累，不同剂量的CCT处理后可消除这种积累（图3A）。 （绿色）线粒体；第三排：CMXRos和FITC的合并图。（D）对\(\Delta \Psi_{m}\)的统计分析。（E）透射电子显微镜（TEM）的代表性图像。红色虚线表示500 μМ游离脂肪酸（FFA）处理48小时；CCT组分别用500 μМ FFA和不同剂量的CCT（2.5、5和10 μM）处理48小时。（A）细胞内三磷酸腺苷（ATP）。（B）图5. CCT对FFA处理的L02细胞线粒体功能的影响。对照组用RPMI - 1640处理48小时；FFA组用细胞色素C氧化酶亚基IV（COX IV）处理。（C）\(\Delta \Psi_{m}\)的代表性荧光图像（放大倍数400倍）。第一排：CMXRos标记的（红色）线粒体；第二排：FITC标记的，下排大于上排。N：细胞核；M：线粒体；LD：脂滴。数值以平均值±\((n=6)\)表示。（关于本图中颜色引用的解释，读者可参考本文的网络版本。） 黄连总碱对L02细胞损伤及氧化应激的影响 与对照组相比，游离脂肪酸（FFA）组细胞内天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的活性显著升高（图4A和B，\(P<0.01）。同样，在游离脂肪酸（FFA）组中观察到甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）的积累（图4C和D）。用不同剂量的CCT处理的三组细胞内丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性显著降低，甘油三酯（TG）水平降低\((P<0.01)\)。然而，只有用5和10 μM的CCT处理才能降低细胞内天冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性\((P<0.01)\)。使用细胞培养基进行了类似的分析。 图6. 斑马鱼CCT的MTC分析中的代表性表型。（H：心脏；J：颌；In：肠道；L：肝脏；Y：卵黄囊；E：眼睛；Sb：鳔）。

黄连总碱对L02细胞线粒体功能的影响 游离脂肪酸（FFA）诱导的脂质积累导致细胞内ATP浓度显著降低（\(P<0.01 vs\)。对照组）。给予5和10 μM的CCT可使细胞内ATP浓度显著增加\((P<0.01)\)（图5A）。此外，在FFA组中观察到COX IV活性显著降低\((P<0.01)\)，这表明FFA的积累影响了线粒体呼吸链功能。值得注意的是，5 μM \((P<0.05)\)和10 μM \((P<0.01)\)剂量的CCT处理可增加COX IV的活性（图5B）。荧光颜色变化表明\(\Delta \Psi_{m}\)发生了变化（图5C）。将红/绿强度比相对于对照组进行定量和归一化显示出相似的结果（图5D）。结果显示，FFA组中\(\Delta \Psi_{m}\)显著降低（G \(P<0.01\)与对照组相比），但在5和10 μM CCT处理组中观察到\(\Delta \Psi_{m}\)显著增加\((P<0.01)\)。此外，通过透射电子显微镜（TEM）分析显示，在FFA处理的细胞中观察到线粒体肿胀和空泡化，伴有嵴的断裂和细胞内脂滴的积累。然而，用不同剂量的CCT处理细胞逐渐恢复了线粒体形态（图5E）。 斑马鱼中CCT的MTC 1000 μM硫代乙酰胺（TAA）与剂量为0.62、1.25、2.5、5或10 μM的CCT联合处理，未对斑马鱼产生任何肉眼可见的毒性作用。然而，20 μM CCT处理后，93%的斑马鱼死亡，40 μM CCT处理后，斑马鱼全部死亡。此外，40 μM CCT处理的斑马鱼出现心包水肿、心律失常、无血流、肾水肿、肌肉变性、体表色素沉着和卵黄囊吸收延迟等情况。所有图6展示了主要畸形组织和器官的图像。因此，CCT的最小毒性浓度（MTC）估计为10 μM。基于这一结果，在后续分析中，10 μM（MTC）、3.3 μM（1/3 MTC）和1.1 μM（1/9 MTC）分别被定义为高、中、低剂量。 黄连解毒汤对斑马鱼脂肪变性的影响 与对照组相比，TAA组斑马鱼肝脏脂肪染色强度显著升高（\((P<0.01)\) 。而SAM联合处理组斑马鱼肝脏脂肪染色强度相对于模型组斑马鱼\((P<0.01)\)显著降低（图7A）。值得注意的是，1.1、3.3和10 μM CCT联合处理的斑马鱼肝脏脂肪染色强度显著降低（图7B和C）。组织病理学观察表明，对照组肝细胞细胞质保存完好，细胞核突出。TAA导致斑马鱼肝脏明显变性，出现不同程度的微小至大空泡。然而，CCT联合处理显著减轻了肝脏空泡变性，改善了肝组织的组织学结构（图7D）。 黄连碱对斑马鱼线粒体功能的影响 与对照组相比，TAA组的ATP生成显著减少（图8A，\((P<0.01)\)）。与TAA组相比，TAA和SAM处理的斑马鱼组的相对发光单位显著更高（图8B，\((P<\) \(0.01\)）。用3.3和10 μM CCT处理的斑马鱼的ATP生成显著增加（图8B，\((P<0.01)\)）。与对照组的表达水平相比，TAA显著下调COX IV mRNA的表达（图8C，\((P<0.01)\)）。与TAA组相比，在TAA和SAM处理的斑马鱼中观察到COX IV mRNA表达水平增加（\((P<0.05)\)）。不同剂量CCT处理的斑马鱼中COX IV的相对mRNA表达显著更高（\((P<0.01)\)）。在TAA组中，COX IV和Bcl - 2的相对蛋白表达水平显著下调（图8D和E，\((P<0.01)\)）。值得注意的是，与TAA组相比，不同剂量CCT处理的斑马鱼显示出显著更高的COX IV和Bcl - 2蛋白表达水平（\(P<0.01\)或\(P<0.05\)）。此外，结果显示与对照组相比，裂解的caspase - 3和Bax的相对蛋白表达水平显著增加（\((P<0.01)\)）。与TAA组相比，用1.1、3.3和10 μM CCT处理斑马鱼显著降低了裂解的半胱天冬酶-3和Bax蛋白表达水平\((P<0.01)\)。

讨论 本研究结果表明，CCT治疗通过在体内和体外调节线粒体功能障碍来改善非酒精性脂肪性肝病。游离脂肪酸（FFA）可诱导非酒精性脂肪性肝病模型中各种细胞的脂质积累，如L02细胞和HepG2细胞（Im等人，2016年；Zhao等人，2020年）。先前的研究报道，油酸（OA）和棕榈酸（PA）以1:2的摩尔比组合可诱导肝细胞中的脂质积累，并促进炎症、氧化应激、细胞凋亡和促纤维化细胞因子的产生，因此可用于建立良性慢性脂肪变性细胞模型（Chavez-Tapia等人，2012年；Gomez-Lechon等人，2007年）。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的斑马鱼模型可通过过量喂食诱导建立，然而，建立该模型耗时较长。因此，硫代乙酰胺（TAA）被用于快速诱导斑马鱼肝脏脂肪变性（浅冈等人，2013年；熊等人，2019年）。此前有研究使用5毫克/毫升的TAA建立斑马鱼肝脏脂肪变性模型，然而，本研究初步实验结果表明，使用1000微摩尔的TAA成功建立了NAFLD模型。 通过油红O染色对脂质积累水平进行可视化评估。相对于L02细胞，肝脏组织对染料的吸附力明显更强，因此，在细胞模型中分析用异丙醇洗脱油红O染色的情况，而对于斑马鱼模型则直接计算肝脏脂肪染色强度（Shu等人，2007年；Turola等人，2015年）。油红O染色结果表明，在游离脂肪酸（FFA）诱导的L02细胞和硫代乙酰胺（TAA）诱导的斑马鱼中均出现脂滴积累。值得注意的是，CCT处理显著减少了脂滴。 积累并减轻脂肪变性，以及降低细胞内甘油三酯（TG）水平。脂滴的积累会诱导TG生物合成以及以天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）活性升高为特征的肝细胞损伤（Jiang等人，2019年；Yin等人，2014年）。在本研究中，CCT处理降低了细胞内TG的积累以及ALT和AST的活性。除了在细胞培养基中观察到类似的趋势。对甘油三酯（TG）水平的影响。对TG影响的差异可能归因于大多数TG在细胞内积累，而不是释放到培养上清液中（阿尔维斯 - 贝泽拉和科恩，2017年）。氧化应激增加在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发展中起着关键作用（彼得罗科拉和布拉沃 -圣佩德罗，2021年）。先前的一项研究报告称，丙二醛（MDA）水平显著升高，在高脂饮食诱导的Sprague-Dawley大鼠非酒精性脂肪性肝病模型，与正常组相比，其超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性较低（Qiu等人，2020年）。与以往研究结果相似，本研究结果表明，CCT提高了抗氧化酶的活性，同时脂质过氧化水平降低。 图8. CCT对硫代乙酰胺（TAA）处理的斑马鱼线粒体功能的影响。对照组用养鱼水饲养72小时；TAA组用1000 μM TAA处理72小时；SAM组用1000 μM TAA和50 μM SAM处理72小时；CCT组分别用1000 μM TAA和不同剂量的CCT（1.1、3.3和10 μM）处理72小时。(A) ATP生成量。(B) ATP百分比。(C增加) 细胞色素c氧化酶亚基IV（COX IV）的相对mRNA表达水平。(D) COX IV、裂解的半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）、Bax和Bcl-2的蛋白表达。(E) 蛋白表达的半定量分析。数值以平均值±标准差表示（\(n=3 or 10)\) \(*P<\) 0.05 且\(* * P<0.01 vs\) 对照组。\(^{*} P<0.01\) 且\(* * P<0.01\) 与TAA组相比。 图9. CCT对非酒精性脂肪性肝病保护作用机制示意图 在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型中，三磷酸腺苷（ATP）的产生与脂肪酸β-氧化和氨基酸分解代谢密切相关（Badolati等人，2020年）。体外和体内实验结果表明，CCT能有效增加ATP的产生，并进一步缓解NAFLD模型中线粒体膜电位的丧失。先前的研究报道，细胞色素c氧化酶亚基IV（COX IV）水平降低会促进细胞凋亡，进而导致早期肝脏变性（Lima等人，2016年；Yamauchi等人，2014年）。COX IV是一种跨膜蛋白复合物，在肝脏的生理平衡中发挥着重要作用。肝细胞中COX IV的缺乏会增加应激状态下肝细胞凋亡的风险（Luo等人，2020年）。此外，COX IV是线粒体电子传递链中的末端电子受体，参与线粒体内膜的ATP合成（Prasun，2020年）。一项对正常小鼠和NAFLD小鼠肝脏蛋白质周转的比较研究表明，在NAFLD小鼠模型中COX IV明显失调。本研究结果显示，在NAFLD模型中，体内和体外的COX IV活性均显著降低，而CCT处理可增加COX IV活性，这与先前的研究结果一致。COX IV参与恢复线粒体呼吸电位，对NAFLD的治疗具有有益作用。本研究测定了促凋亡因子裂解的半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）和Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，以探讨CCT对线粒体功能的影响（Fosu-Mensah等人，2019年）。蛋白质免疫印迹分析表明，本研究中Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表达水平支持了CCT抑制NAFLD模型中线粒体凋亡这一假设。 综上所述，本研究结果表明，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与L02细胞的氧化应激和线粒体功能障碍有关。此外，NAFLD的特征是丙二醛（MDA）水平显著升高、抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT））活性降低、三磷酸腺苷（ATP）合成减少、线粒体形态异常以及细胞色素c氧化酶Ⅳ（complex IV）的信使核糖核酸（mRNA）表达水平降低。如图9所示，CCT处理减轻了丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性的升高，并促进了抗氧化酶（SOD、CAT）活性的增加。此外，CCT显著促进了ATP生成的增加，并上调了细胞色素c氧化酶亚基Ⅳ（COX IV）的mRNA表达。对硫代乙酰胺（TAA）诱导的斑马鱼NAFLD模型的分析表明，CCT显著下调Bax和裂解的半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）蛋白的表达，并上调Bcl-2蛋白的表达，以减轻线粒体功能障碍导致的线粒体凋亡。\(\Delta \Psi_{m}\)的增加和线粒体形态缺陷的恢复进一步证实了线粒体功能的恢复。

结论

综上所述，本研究结果表明，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病机制与线粒体功能障碍有关。据我们所知，本研究首次利用L02细胞和斑马鱼模型报道了CCT对NAFLD的治疗作用。CCT作为一种治疗NAFLD的药物具有很高的潜力，因为它可以调节线粒体功能障碍，改善脂质积累，因此可用于NAFLD的临床治疗。

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