专题｜生长激素释放相关肽GHRL-12在免疫检查点抑制剂相关心肌炎小鼠中的作用与机制研究

中国心血管杂志2024Chinese Journal of Cardiovascular Medicine

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生长激素释放相关肽GHRL-12在免疫检查点

抑制剂

相关心肌炎小鼠中的

作用与机制研究

Role and mechanism of growth hormone release related peptide GHRL-12 in mice with immune checkpoint inhibitor-related myocarditis

汪雪君 沈毅辉 张卉 陈怡帆 许宇辰 张健 程蕾蕾

作者单位：200032 上海市心血管病研究所、国家放射与治疗临床医学研究中心、复旦大学附属中山医院心脏超声诊断科、上海市影像医学研究所

通信作者：程蕾蕾，电子信箱：cheng.leilei@zs-hospital.sh.cn

引用本文:

汪雪君, 沈毅辉, 张卉, 等. 生长激素释放相关肽GHRL-12在免疫检查点抑制剂相关心肌炎小鼠中的作用与机制研究[J]. 中国心血管杂志, 2024, 29(2): 112-121. DOI:

10.3969/j.issn.1007-5410.2024.02.004.

zhai

摘

yao

要

目的

探讨生长激素释放相关肽GHRL-12在免疫检查点抑制剂相关心肌炎中的作用与机制，为其临床应用提供理论依据。

方法

6～8周龄BALB/c小鼠，采用随机数生成器，随机分为对照组、心肌炎组、GHRL-12组和GHRL-12＋心肌炎组。GHRL-12组和GHRL-12＋心肌炎组小鼠尾静脉注射10 mg/kg GHRL-12连续1周，同时对照组和心肌炎组小鼠尾静脉注射同等体积的无功能scramble肽。在第7天和第14天分别给予心肌炎组和GHRL-12＋心肌炎组小鼠250 μg心肌肌钙蛋白I(cTnI)，从第14天开始，每间隔1天给予小鼠腹腔注射5 mg/kg anti-PD-1，共5次。每7天称量小鼠体重，测量小鼠心体比和心胫比。超声心动图检测心功能指标。HE染色检测心肌组织炎症细胞浸润程度，Masson染色检测心肌组织纤维化程度，并用ImageJ对炎症细胞浸润和纤维化程度进行量化。取小鼠眼球血，检测血清中肌酸激酶(CK)、CK同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶1(LDH-1)变化。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中炎症因子cTnI、cTnT、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)释放情况。蛋白质印迹技术测定小鼠心肌组织中自噬相关蛋白高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、酵母Atg6同源物(Beclin-1)、自噬基因-相关蛋白5(ATG5)和微管相关蛋白轻链3B(LC3B)的表达，同时测定小鼠心肌组织中凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表达。对心肌细胞核用DAPI染成蓝色，凋亡细胞被TUNEL染成绿色，检测小鼠心肌组织发生凋亡的情况。

结果

(1)与对照组相比，GHRL-12组小鼠体重无显著差异，心肌炎组小鼠体重增长不明显；与心肌炎组比较，给药第19天起GHRL-12＋心肌炎组小鼠体重增长较为明显。与对照组和GHRL-12组相比，心肌炎组小鼠心体比、心胫比显著增加，而与心肌炎组小鼠相比，GHRL-12＋心肌炎组小鼠心体比、心胫比下降。(2)超声心动图显示，单纯给予GHRL-12干预对小鼠心功能无显著影响，与对照组相比，心肌炎组小鼠左心室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS)显著下降，左心室收缩末期内径(LVEDs)、左心室舒张末期内径(LVEDd)显著增加；而与心肌炎组小鼠相比，GHRL-12＋心肌炎组小鼠LVEF、FS升高，LVEDs、LVEDd减少。(3)HE染色结果显示，与对照组小鼠相比，心肌炎组小鼠炎症细胞浸润显著增加，而与心肌炎组小鼠相比，GHRL-12＋心肌炎组小鼠炎症细胞浸润减少。(4)Masson染色结果表明，与对照组小鼠相比，心肌炎组小鼠心肌组织纤维化程度增加，而与心肌炎组小鼠相比，GHRL-12＋心肌炎组小鼠心肌组织纤维化程度降低。(5)与对照组小鼠相比，心肌炎组小鼠血清中CK、CK-MB、LDH-1、cTnI和cTnT均显著上升，而与心肌炎组小鼠相比，GHRL-12＋心肌炎组均显著下降。(6)蛋白质印迹结果显示，与对照组小鼠相比，心肌炎组小鼠心肌组织HMGB1、Beclin-1、ATG5和LC3B蛋白表达均显著增加，而与心肌炎组小鼠相比，GHRL-12＋心肌炎组均显著下降；同时，心肌炎组Caspase-3和PARP蛋白表达均显著增加，GHRL-12＋心肌炎组均显著减少。(7)TUNEL结果显示，与对照组小鼠相比，心肌炎组小鼠心肌组织凋亡显著增加，与心肌炎组小鼠相比，GHRL-12＋心肌炎组小鼠心肌组织凋亡显著下降。

结论

多肽GHRL-12能够改善免疫检查点抑制剂诱导的心功能损伤，减少心肌组织中炎症细胞浸润和纤维化，抑制心肌组织凋亡和自噬，为未来免疫检查点抑制剂相关心肌炎的治疗提供潜在可能。

自2011年以来，免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)的应用为晚期恶性肿瘤治疗带来了新的选择[1]。不过，临床数据表明，有1.14%的患者罹患ICIs相关心肌炎，死亡率接近50%[2]。ICIs相关心肌炎临床表现为胸痛、呼吸急促、肺水肿甚至心原性休克，还可能出现心律失常，导致晕厥和猝死[3]。目前，针对ICIs相关心肌炎主要以大剂量激素冲击治疗为主。但在临床诊疗中发现，一部分患者因出现激素抵抗使临床获益率降低，这部分患者最终可能发生不良心血管事件[4]。因此，为ICIs相关心肌炎寻找高敏感性和特异性的治疗手段迫在眉睫。

ICIs是阻断T细胞免疫反应阴性调节剂的一类蛋白类分子，包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4)、程序化细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)和PD-1配体(PD-L1)。PD-1、PD-L1和CTLA-4信号的完整性对于下调心肌的过度免疫反应至关重要[5]。其中，PD-1是一种在T细胞、活化自然杀伤细胞、B细胞、单核细胞和未成熟的朗格汉斯细胞上表达的共抑制分子[6]。PD-1可与配体PD-L1和PD-L2结合。虽然PD-L2的表达仅限于巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞，但PD-L1由淋巴细胞和非淋巴细胞表达，包括心脏和内皮细胞[7]。有研究表明，PD-L1仅在受伤心肌细胞的细胞表面表达，可能通过将心肌细胞抗原暴露在T细胞面前而引发细胞死亡[8]。

多肽是由蛋白酶体降解产生，可作为内源性配体或受体介导多种信号通路发挥重要作用[9]。研究表明，除心钠肽和脑钠肽以外，循环抗微生物肽LL-37已成为心血管疾病中的新型生物标志物[10]。而ELA-11在多柔比星引起的心脏毒性中通过抑制凋亡保护心肌细胞[11]。Ghrelin是生长激素分泌受体的内源性配体，参与调节生长激素释放、免疫细胞激活和炎症[12]。有研究显示，Ghrelin通过Nrf2/NADPH/ROS通路改善心肌梗死后纤维化[13]。基于前期研究，我们将内源性配体纯化后得到一条由12个氨基酸组成的，在物种间高度保守的多肽，将其命名为GHRL-12，在既往研究中尚未见报道。本研究将通过构建ICIs相关心肌炎小鼠模型，系统评估GHRL-12对心肌细胞的作用与机制，为其临床应用提供理论依据。

01材料与方法1.1主要试剂和仪器课

GHRL-12及scramble肽合成购自上海科肽生物科技有限公司。苏木精-伊红(HE)和马松三色(Masson)染色试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。凋亡检测试剂盒与DAPI购自上海碧云天生物技术有限公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)购自美国Merck公司。脱脂牛奶、洗膜缓冲液(TBST)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗体#14220，#9542(1∶1 000)购自美国Cell Signaling Technology公司。81115-1-RR，10181-2-AP，11306-1-AP和14600-1-AP(1∶1 000)购自武汉三鹰生物技术有限公司。心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)I、cTnT、白细胞介素(interleukin，IL)-6，IL-1β和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA检测试剂盒均购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。Vevo2100超声系统购于加拿大VisualSonics公司。

1.2动物模型构建

选取6～8周龄BALB/c小鼠，体重20～25 g，共24只，SPF级环境饲养。采用随机数生成器，将小鼠随机分为对照组(CON group)、心肌炎组(ICIs group)、单纯给予GHRL-12组(GHRL-12 group)和GHRL-12＋心肌炎组(GHRL-12＋ICIs group)，每组各6只。GHRL-12组和GHRL-12＋心肌炎组小鼠尾静脉注射10 mg/kg GHRL-12连续1周，同时对照组和心肌炎组小鼠尾静脉注射同等体积的无功能scramble肽(序列：QRKKQSKVPPAE)。在第7天和第14天分别给予心肌炎组和GHRL-12＋心肌炎组小鼠250 μg cTnI，从第14天开始，每间隔1天给予小鼠腹腔注射5 mg/kg anti-PD-1，共5次(图1)。当超声心动图显示小鼠心功能下降，心肌组织病理切片显示明显炎症细胞浸润，表明造模成功。所有动物实验均符合美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》(美国国立卫生研究院出版物第85-23号，1996年修订版)，并经复旦大学附属中山医院动物实验伦理审查批准。

图1 小鼠给药及模型建立

1.3超声心动图检测

在动物模型构建完成后，将小鼠放置于含有2%异氟醚(河北一品制药股份有限公司，中国上海)的诱导室中，持续供氧2 L/min。待小鼠麻醉完全后，将其平卧置于等温实验台上。使小鼠心率维持在350～550次/min，经胸超声心动图使用30 MHz高频扫描探头(visualsonic Vevo2100; visualsonic, Toronto, Canada)，记录M模式图像。测量左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、缩短分数(fractional shortening，FS)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd)和左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension，LVEDs)。所有测量均取连续3个心动周期的平均值。

1.4HE染色

用10%水合氯醛腹膜麻醉小鼠，待麻醉完全后，对心腔内血液进行灌流。用组织固定液固定心脏7 d。组织在乙醇和二甲苯作用下呈透明状。将透明组织浸泡在熔化的石蜡中进行包埋。冷却凝固后，切成5 μM大小的薄片，压平，贴在载玻片上，45℃培养箱中干燥。再次去蜡，分别用苏木精和伊红染色。苏木精将细胞核和细胞内核糖体染成蓝色和紫色，伊红将细胞质染成红色。

1.5Masson染色

按上述方法进行组织切片。用Weigert弹力纤维染色液对细胞核染色5～10 min，洗涤后用ponceau酸品红溶液染色5～10 min。取出切片，依次用2%冰醋酸溶液浸泡30 s和1%磷酸钼酸盐溶液分化3～5 min。然后用苯胺蓝染色5 min，再用0.2%冰醋酸溶液浸泡30 s。最后，依次用95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明胶和中性胶密封切片。

1.6TUNEL染色

准备好组织切片，在样本上滴加适量蛋白酶K，使其完全浸润，置于37℃恒温培养箱中消化30 min后用PBS洗去多余蛋白酶K。随后加入TdT酶，在37℃培养箱中反应2 h。待反应完成后，用PBS洗涤样本。最后滴加适量dUTP标记物进行染色标记，在37℃培养箱中孵育30 min。染色结束后用PBS洗净，置于荧光显微镜下观察。

1.7蛋白质印迹技术

将组织块加入按照比例配制好的蛋白裂解液中，组织匀浆仪裂解3次。将裂解液置于冰上裂解30 min后，将裂解液置于4℃，12 000 r/min离心15 min。根据上清体积加入1/4体积的5×SDS。100℃煮沸10 min。冷却后，1 000 r/min离心1 min。蛋白质样品依次进行电泳、跨膜、密封、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、曝光。鉴定蛋白表达。

1.8心肌损伤酶谱检测

取小鼠眼球血，收集血浆，4℃，3 000 r/min离心15 min，收集上清。按厂家说明配制工作试剂。在自动生化仪上设置相应的参数后，自动测量并得出样品结果，包括肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、乳酸脱氢酶1(lactate dehydrogenase 1，LDH-1)。

1.9酶联免疫吸附试验

取小鼠上清。用碳酸盐包被缓冲液稀释抗体至蛋白含量为1～10 μg/ml。每孔加100 μl于聚苯乙烯酶标记板4℃过夜。第2天丢弃溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤3 min。每孔加密封溶液200 μl，37℃孵育1～2 h。除去密封液，加入300 μl洗液，浸泡1～2 min，在吸水纸上拍干，重复3～5次。依次按步骤加入待测样品、生物化抗体、酶结合工作液和TMB底物溶液孵育。酶结合工作液和TMB底物溶液应避光孵育。当双倍稀释的标准孔出现明显的颜色梯度时，在每个反应孔100 μl中加入2 M硫酸。当颜色由蓝色变为黄色时，检测相应波长的OD值。根据标准品的浓度和OD值绘制标准曲线，然后根据标准曲线方程计算样品浓度。

1.10统计学方法

采用GraphPad Prism软件进行数据分析。计量资料用M±SD表示，每组至少有3个独立实验，两组间比较采用双尾t检验；多组间比较采用单因素方差分析和Bonferroni事后检验。P<0.05为差异有统计学意义。

02结果2.1GHRL-12对ICIs相关心肌炎小鼠体重和心功能的影响

为探索GHRL-12对ICIs相关心肌炎小鼠的作用，我们按照图1进行小鼠分组及给药。为了解GHRL-12对小鼠一般状态的影响，每7天测量小鼠体重。结果表明，与对照组比较，GHRL-12组小鼠体重无明显差异，而心肌炎组小鼠体重增长不明显，从第19天开始心肌炎组与对照组体重相比，表现出统计学差异(P＝0.025)。第31天，与心肌炎组比较，GHRL-12＋心肌炎组小鼠体重增长较为明显(图2A)。经造模完成后，测量小鼠心体比和心胫比发现，与对照组和GHRL-12组相比，心肌炎组小鼠心体比、心胫比显著增加；与心肌炎组比较，GHRL-12＋心肌炎组小鼠心体比、心胫比显著下降(图2B~2C)。超声心动图显示，单纯给予GHRL-12小鼠心功能无明显变化(图2D)；与对照组相比，心肌炎组小鼠LVEF、FS均下降，LVEDs、LVEDd均上升；而经GHRL-12干预后LVEF、FS有所上升，LVEDs、LVEDd有所下降(图2E~图2H)。因此，GHRL-12能一定程度改善ICIs相关心肌炎小鼠一般状况和心功能。

图2 GHRL-12对ICIs相关心肌炎小鼠体重和心功能的影响

2.2GHRL-12对ICIs相关心肌炎小鼠心肌组织炎症细胞浸润和纤维化的影响

为进一步明确GHRL-12的作用，我们对各组小鼠心肌组织取样，切片后病理染色。HE染色后，对染色组织，以蓝色为主的点状细胞即为炎症细胞，其中主要是中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，而其他正常细胞则体积较大，细胞质较多呈粉红色，细胞核较小，呈蓝色或深蓝色。HE染色结果表明，对照组和GHRL-12组小鼠心肌细胞排列整齐，细胞形态正常，无明显炎症细胞浸润；而心肌炎组小鼠心肌组织有明显炎症细胞浸润，GHRL-12＋心肌炎组小鼠心肌组织中炎症细胞浸润减少(图3A)。使用ImageJ对炎症细胞浸润情况进行分析发现，心肌炎组与对照组相比、GHRL-12＋心肌炎组与心肌炎组相比，小鼠炎症细胞浸润程度均存在统计学差异(均为P<0.001)(图3B)。Masson染色会将心肌组织中胶原纤维染成蓝色，结果显示心肌炎组小鼠胶原含量较对照组和GHRL-12组明显增加，而GHRL-12＋心肌炎组与心肌炎组相比，小鼠心肌胶原含量明显降低(图3C)。使用ImageJ对组织中胶原纤维含量进行定量分析显示，心肌炎组与对照组相比、GHRL-12＋心肌炎组与心肌炎组相比，小鼠心肌胶原含量均存在统计学差异(均为P<0.001)(图3D)。因此，GHRL-12能显著减轻ICIs相关心肌炎小鼠心肌组织炎症细胞浸润和纤维化程度。

图3 GHRL-12对ICIs相关心肌炎小鼠炎症细胞浸润及纤维化的影响

2.3GHRL-12对ICIs相关心肌炎小鼠心功能损伤的影响

为了确定小鼠发生心肌炎时是否会释放心肌损伤标志物，以及GHRL-12对心肌损伤标志物释放的影响，我们取各组小鼠血清检测心肌酶谱变化。结果表明，与对照组相比，GHRL-12组小鼠血清CK值无显著差异，而心肌炎组小鼠血清CK值显著升高，GHRL-12＋心肌炎组较心肌炎组小鼠血清CK值下降明显(图4A)。同时，单纯给予GHRL-12干预后，小鼠血清中CK-MB无明显变化，而心肌炎组小鼠CK-MB显著上升，GHRL-12＋心肌炎组较心肌炎组小鼠血清CK-MB显著下降(图4B)。同样，GHRL-12可减少ICIs相关心肌炎组小鼠LDH-1的释放(图4C)。心肌炎组小鼠cTnI和cTnT均显著升高，而GHRL-1减少了心肌炎组小鼠cTnI和cTnT的释放(图4D~4E)。因此，GHRL-12可显著减少心肌损伤标志物的释放，减少ICIs对心功能的损伤。

图4 GHRL-12对ICIs相关心肌炎小鼠心功能损伤的影响

2.4

GHRL-12对ICIs相关心肌炎小鼠炎症因子释放的影响

ICIs相关心肌炎时常伴随炎症因子的释放，为了明确GHRL-12是否同样能够降低炎症因子释放，我们利用ELISA检测各组小鼠血清炎症因子释放情况。如图5所示结果，心肌炎组较对照组小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α均显著升高(均为P<0.001)；GHRL-12＋心肌炎组与心肌炎组相比，小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α均显著下降，且差异有统计学意义(均为P<0.001)。由以上结果发现，GHRL-12不仅可以缓解ICIs对心肌的损伤，还可抑制免疫细胞过度激活，抑制炎症因子释放。

图5 GHRL-12对ICIs相关心肌炎小鼠炎症因子释放的影响

2.5

GHRL-12对细胞凋亡和自噬的影响

为进一步探索GHRL-12抑制ICIs相关心肌炎进展的具体机制，我们利用蛋白质印迹技术检测细胞凋亡和自噬相关蛋白表达。结果显示，与对照组相比，心肌炎组小鼠心肌组织中自噬关键蛋白酵母Atg6同源物(Beclin-1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、自噬基因-相关蛋白5(ATG5)和微管相关蛋白轻链3B(LC3B)表达均显著增加；仅GHRL-12干预并不能影响自噬，而与心肌炎组相比，GHRL-12＋心肌炎组小鼠Beclin-1、HMGB1、ATG5和LC3B则显著降低(图6A~6E)。对心肌组织进行TUNEL染色，DAPI染细胞核呈蓝色，发生凋亡的心肌细胞将被TUNEL染色呈绿色。结果表明，对照组与GHRL-12组发生凋亡的心肌细胞无显著差别。心肌炎组发生凋亡的心肌细胞显著增多，而GHRL-12＋心肌炎组凋亡心肌细胞显著减少(图6F~6G)。蛋白质印迹技术进一步检测凋亡相关蛋白变化，发现心肌炎组小鼠心肌组织中cleaved-Caspase-3和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)均显著激活，而GHRL-12＋心肌炎组较心肌炎组小鼠则被一定程度抑制，且差异有统计学意义(均为P<0.001)(图6H~6J)。因此，我们发现GHRL-12可通过抑制细胞凋亡和自噬来改善ICIs相关心肌炎的进展。

图6 GHRL-12对细胞凋亡和自噬的影响

03讨论

本研究系统探索了生长激素释放相关肽GHRL-12在ICIs相关心肌炎中的作用与机制。研究结果表明，多肽GHRL-12能减轻因ICIs引起的小鼠心肌组织炎症细胞浸润、纤维化和炎症因子释放，并改善心肌炎小鼠的心功能，同时通过抑制心肌细胞凋亡和自噬，减轻ICIs引起的心肌损伤。凋亡和自噬是驱动ICIs损伤心肌细胞的重要因素，抑制ICIs相关心肌炎小鼠发生凋亡和自噬，将为未来治疗ICIs相关心肌炎提供潜在靶点。

PD-1及其配体PD-L1是关键的免疫检查点蛋白，通过负调控T细胞免疫功能的稳定性和完整性，上调免疫和炎症反应，靶向抑制PD-1/PD-L1信号可有效抑制恶性肿瘤的进展[14]。尽管靶向PD-1/PD-L1的药物作为一种新型的癌症治疗手段应用于临床中，但PD-1/PD-L1抑制剂的应用对心肌细胞的毒性作用限制了其临床应用[15]。有研究报道，PD-1/PD-L1抑制剂诱发的心肌炎具有发病迅速、死亡率高的特点，中位死亡时间仅为32 d，最终病死率高达46%[16]。心肌炎的临床表现包括急性心力衰竭、心律失常，甚至心原性休克。在ICIs相关心肌炎中，心肌损伤标志物如心肌肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶呈不同程度升高，其中以肌钙蛋白特异性最高[17]。如果炎症浸润到传导系统，可表现为各种形式的心律失常[18]。早期组织病理学检查显示，炎症部位存在大量炎症细胞浸润，炎症细胞通过释放各种炎症因子损伤心肌细胞[19]。在早期病变中仅观察到炎症细胞即可诊断为心肌炎。随着临床诊疗中ICIs相关心肌炎的发病率逐渐升高，明确其发病机制显得尤为重要。

目前有数据支持T细胞介导的免疫是ICIs相关心肌炎发病机制的重要组成部分，但仍然存在很多问题。如，什么是煽动性心脏抗原？为什么这些自身抗原会引起免疫反应？先天免疫细胞和B细胞是否发挥作用？涉及哪些心脏细胞类型？心脏细胞功能障碍从哪些方面表现出来？细胞死亡是否是发病机制的关键组成部分，如果是，则涉及哪些细胞死亡[20]？这些都是亟待解决的关键科学问题。我们通过测量小鼠体重观察小鼠一般情况变化，超声心动图系统评估了ICIs相关心肌炎小鼠心功能变化，并检测了小鼠血清中心肌损伤标志物。结果表明，ICIs相关心肌炎小鼠体重增长不明显，LVEF、FS值降低，LVEDs、LVEDd升高，血清CK、CK-MB和LDH-1上升，以上均证实小鼠心功能受到损害。利用ELISA检测心肌酶谱标志物和炎症因子释放，结果显示心肌炎小鼠cTnI、cTnT显著升高，表明当发生ICIs相关心肌炎时，cTnT、cTnI可作为指标用于临床监测。发生心肌炎时，炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α呈不同程度升高，因此ICIs相关心肌炎发生时可能会伴随免疫细胞激活，使炎症因子释放增加。

细胞死亡是细胞受到损伤后发生的终末期事件[21]。细胞死亡包括程序性死亡和非程序性死亡，前者在细胞死亡中占据重要地位，包括凋亡、自噬、焦亡与坏死性凋亡[22]。细胞凋亡是程序性死亡的典型形式，当细胞皱缩、细胞质和细胞核发生凝结时，细胞发生凋亡[23]。发生凋亡的细胞最终会被附近的巨噬细胞和其他细胞吞噬[24]。由于细胞凋亡时细胞内容物并未释出，且吞噬细胞不会释放炎症细胞因子，因此凋亡不会发生免疫反应[25]。细胞凋亡的发生机制包括一系列称为Caspases的半胱氨酸蛋白酶的顺序激活。当细胞受到DNA损伤、活化致癌基因、缺氧、氧化应激和辐照等死亡信号刺激时，促凋亡因子被上调，激活Caspases发生级联反应，促进凋亡[26]。另一种程序性死亡即自噬。大自噬是一种细胞"自食"过程，其中大细胞质和细胞器被隔离在自噬体的双膜囊泡内[27]。自噬体反过来与溶酶体融合，以促进细胞内容物的降解[28]。自噬细胞死亡的特点是没有染色质凝结和细胞质的广泛自噬空泡化[29]。自噬的严格调控取决于一组进化保守的基因，如ATG和自噬途径相关蛋白，如Beclin-1共同调节。Beclin-1通过与凋亡细胞死亡途径的调节蛋白相互作用，在这两种形式细胞死亡之间的交叉对话中发挥重要作用，动态调节生理和病理生理过程[30]。miR-103a-3p能够同时抑制凋亡和自噬减少缺血对心肌细胞的损伤[31]。在我们的研究结果中发现，与自噬相关的蛋白Beclin-1、HMGB1和ATG5表达显著上升，凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP也增加，表明ICIs相关心肌炎小鼠心肌细胞中凋亡和自噬水平增加。

多肽具有分子量小、免疫反应小、毒性低等优势，已经成为生物药物研发的热点之一。GHRL-12具有改善ICIs相关心肌炎小鼠心功能，减少心肌组织炎症细胞浸润和纤维化，抑制心肌损伤标志物和炎症因子释放，抑制心肌细胞发生凋亡和自噬的作用。本研究结果将为未来探索ICIs相关心肌炎的治疗策略提供新的理论依据。

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ISSN号：1007-5410

CN号：11-3805/R

创刊时间：1996年12月

出版日期：双月25日

出版刊期：双月刊

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